*Corresponding author: Hong-Gu Joo Laboratory of Veterinary Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Jeju National University, 102 Jejudaehak-ro, Jeju 63243, Korea 서론
Fenbendazole (FBZ)은 수의에서 유용하게 쓰이는 구충제 중 하나이다[1]. FBZ은 실험용 설치류, 반려동물, 산업동물에서 회충, 십이지장충, 편충 등 내부 기생충 감염의 예방 및 치료제로 허가 받아 사용되고 있다[2,3]. 구충 작용기전으로는 기생충의 세포 분열 과정 중 미세소관의 형성을 방해하여 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다[4,5].
최근 FBZ이 항암효과가 있다는 보고[6]와 일부 임상사례를 시작으로 커뮤니티, 인터넷을 통해 FBZ을 임의로 복용하는 사례가 증가하였다. FBZ은 인간 암세포의 미세소관에 친화성을 나타내고 micromolar 농도에서 항암효과를 보였으며, 새로운 항암기전으로 GLUT transporter와 hexokinase의 발현 억제로 glucose uptake를 효과적으로 억제하는 사실이 알려졌다[6].
골수는 혈액세포와 면역세포가 유래하는 기관으로 면역체계에서 매우 중요한 역할을 한다. 우리는 FBZ이 항암제로서의 가능성이 대두되고 있는 가운데 골수세포에 대한 항염증 효과 또한 있는지 의문이 들었다. 하지만 앞선 연구에서는 조류에서 선충 감염으로 인해 발생한 골수염에 FBZ을 투여하여 치료한 사례만이 존재하였다[7]. 이와 같이, FBZ의 골수염에 대한 효과에 관한 연구는 많이 부족하다. 따라서 본 연구에서는 in vitro에서 골수염과 유사한 상황을 만들기 위해 대표적인 염증 유발물질인 lipopolysaccharide (LPS)를 골수세포에 처리하여 FBZ의 항염증 효과 유무와 작용기전을 알아보았다. 이를 위해 FBZ을 농도별로 처리한 후 골수세포의 대사활성도, 표면 마커 발현, 세포의 핵 형태, 미토콘드리아 막전위(mitochondrial membrane potential) 등을 측정하여 골수세포에서 FBZ의 항염증 효과에 대해 연구하였다.
재료 및 방법
실험동물과 시약
실험동물은 OrientBio (Korea)에서 구입하여 제주대학교 실험동물센터에서 유지하였다. 동물실험에서 8-12주령 사이의 C57BL/6 마우스가 사용되었고, 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 시행되었다(승인번호, 2018-0011). FBZ과 LPS (Escherichia coli O55)는 Sigma사(USA)에서 구입하였으며, FBZ은 dimethyl sulfoxide, LPS는 인산완충액에 녹인 후 사용하였다.
골수세포의 분리와 물질 처리
본 실험실에서 확립된 방법으로 골수세포를 분리하였다[8]. CO2 gas로 마우스를 안락사 시킨 뒤 대퇴골과 경골을 적출하여 골수조직을 채취하였다. 이 조직을 ammonium chloride-potassium lysis buffer로 처리하여 적혈구를 제거한 후 70 µm cell strainer에 걸러 single cell을 획득하였다. 이를 계수하여 96- 또는 6-well culture plates에 배양하였다. FBZ과 LPS를 처리한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였고 분석에 이용하였다.
골수세포의 대사활성도 측정
골수세포를 1 × 106 cells/mL의 농도로 96-well culture plate에 넣은 후 FBZ과 LPS (1 µg/mL)를 농도별로 처리한 후 배양하였다. 배양이 끝난 후 골수세포에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT, Sigma) 용액을 0.5 mg/mL 농도로 넣고 4시간 동안 처리하였다[9]. 살아있는 세포에 의해 생긴 crystal violet을 녹이기 위해 10% sodium dodecyl sulfate 용액을 well당 100 μL씩 넣어 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 microplate reader (Molecular Devices사, USA)를 이용하여 흡광도(570 nm)를 측정하였다.
유세포 분석
마우스 골수세포를 6-well culture plate에 1 × 106 cells/mL의 농도로 배양하고 FBZ과 LPS를 농도별로 처리하였다. 3일간 배양 후 미토콘드리아 막전위를 측정하기 위해 rhodamine 123 용액을 10 μg/mL의 농도로 암실조건에서 30분간 염색하였다. 골수세포의 세포사(cell death) 측정을 위해 annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate (FITC)와 propidium iodide (PI) 용액으로 염색하였다[10]. 또한, 과립구와 B림프구의 비율을 측정하기 위해 allophycocyanin-labeled anti-Gr-1 항체와 biotin-labeled anti-B220 항체, FITC-avidin을 사용하였다. 유세포 분석은 CytoFLEX와 CytExpert software (Beckman Coulter, USA)를 이용해 분석하였다.
Hoechst 33342 염색을 이용한 골수세포 핵 관찰
골수세포의 세포사를 확인하기 위해 핵 모양을 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위해 Hoechst 33342 용액을 2.5 μg/mL 농도로 처리하여 37°C에서 10분간 염색하였다[11]. 염색된 세포는 형광현미경(ZOE Fluorescent Cell Imager; BIO-RAD, USA)을 이용해 관찰하였고 사진 촬영을 했다.
통계분석
각 실험은 2-3회 반복하여 시행되었다. Fig. 1은 평균 ± 표준편차로 나타냈다. One way analysis of variance 분석 후에 Turkey-Kramer multiple comparison test (GraphPad Prism; GraphPad Software, USA)로 유의성을 확인하였다. 통계처리 후 p-value가 0.05 미만인 경우 유의한 것으로 판단하였다.
결과
FBZ이 골수세포의 대사활성도에 미치는 영향
FBZ 단독과 FBZ + LPS (1 μg/mL) 처리군에서 골수세포의 대사활성도를 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다(Fig. 1). MTT assay 결과 FBZ 단독에 비해 FBZ + LPS 처리군은 모든 농도(0-1 µM)에서 보다 높은 대사활성도를 나타내었으며, FBZ의 농도가 증가함에 따라 대사활성도가 감소됨을 확인하였다. 특히, FBZ 단독의 0.5-2 µM 농도에서 유의하게 대사활성도가 감소하였고, FBZ + LPS 처리군에서는 1-2 µM 농도에서 유의한 감소를 보였다. 이러한 결과는 FBZ이 LPS와 같은 염증 물질에 의해 자극된 골수세포의 활동을 억제할 수 있음을 나타낸다.
FBZ에 의한 골수세포의 미토콘드리아 막전위 변화
FBZ이 골수세포에 미치는 영향을 조사하기 위해 FBZ과 LPS를 처리한 골수세포의 미토콘드리아 막전위를 측정하였다. 이를 위해 rhodamine 123 용액을 사용하여 골수세포를 염색한 후 유세포 분석을 하였다(Fig. 2). LPS는 골수세포의 미토콘드리아 막전위를 높이는 반면, FBZ은 LPS로 증가된 미토콘드리아 막전위를 크게 감소시켰다. 특히, FBZ 0.25 µM 농도와 FBZ 1 µM 농도의 fluorescence intensity 평균값의 차이는 5,034로, FBZ 0 µM 농도와 FBZ 0.25 µM 농도의 평균값의 차이인 1,083보다 크다. 이 결과는 0.25-1 µM 사이 농도의 FBZ은 LPS에 의해 자극된 골수세포의 미토콘드리아 이중막의 구조를 더욱 불안정하게 할 수 있음을 나타낸다.
FBZ에 의한 골수세포의 세포사 증가
유세포 분석은 골수세포의 세포사를 확인하기 위해 annexin V-FITC/PI 염색 후 수행되었다(Fig. 3). FBZ 단독 또는 FBZ + LPS 처리된 세포의 viable cells (annexin V-/PI-)의 비율이 유사하게 감소하였다. 이 감소는 특히 Fig. 2와 같이 FBZ 1 µM 농도에서 현저하게 감소함을 보였다. Viable cells는 FBZ 단독일 때 FBZ 0-0.25 µM은 2.3%, FBZ 0.25-1 µM은 13.8% 감소하였다. FBZ + LPS 처리군에서도 FBZ 0-0.25 µM은 3.4%, FBZ 0.25-1 µM은 9.3% 감소하였다. 죽은 세포 중 necrotic cells (annexin V-/PI+)의 수는 FBZ 0-1 µM 농도에서 5%에서 6%로 증가한 FBZ 단독에 비해 FBZ + LPS 처리군에서 더욱 현저한 변화를 보였다. 그러나 early apoptosis cells (annexin V+/PI-)에서는 FBZ 단독은 6%에서 12%로 증가한 반면, FBZ + LPS 처리군에서는 10%로 일정하였다. 이러한 결과는 FBZ이 LPS 처리 여부와 관계없이 골수세포에서 세포사를 유도할 수 있음을 보여준다.
골수세포 내의 과립구와 B림프구의 구성에 FBZ이 미치는 영향
마우스 골수세포의 주요 구성 세포 중에는 과립구와 B림프구가 포함되어 있다. 두 가지 세포 구성에 FBZ이 미치는 영향을 조사하기 위해, FBZ과 LPS로 처리된 골수세포를 Gr-1 또는 B220 특이적인 항체로 염색한 후 유세포 분석을 실시하였다(Fig. 4). Dot plot의 Gr-1+ 구역은 호중구를 포함한 과립구이다. FBZ 0 µM 농도에서 FBZ 단독은 27%, FBZ + LPS 처리군은 25%인 것으로 보아 LPS는 과립구의 비율을 크게 증가시키지 않았다. 반면, FBZ 0-1 µM 사이의 변화를 보면 FBZ 단독에서는 27%에서 15%로 감소하였고 FBZ + LPS 처리군에서는 25%에서 19%로 감소하였다. 골수세포에 LPS 처리와 관계없이 과립구의 비율은 현저하게 감소시키는 사실을 알 수 있다. Dot plot의 B220+ 구역은 B림프구이다. B림프구의 비율은 LPS에 의해 증가하지 않았고, 28%에서 20%로 오히려 감소한 모습을 보였다. 반면, LPS 유무와 관계없이 FBZ의 농도가 증가함에 따라 B림프구의 비율은 증가하였다.
FBZ에 의한 골수세포의 핵 형태 변화
골수세포를 Hoechst 33342 용액으로 염색한 후, 형광현미경을 사용하여 FBZ에 의한 골수세포의 핵 형태 변화를 관찰하였다(Fig. 5). FBZ 단독 처리군에서는 1 µM 농도에서 눈에 띄게 분절된 핵을 가진 세포의 수가 증가하였다. LPS 처리로 골수세포의 수가 현저하게 증가되었고 FBZ의 1 µM 농도에서 분절된 핵을 가진 세포의 수가 증가하였다. 핵이 분절된 세포가 증가하는 것은 세포사의 증가를 의미하므로 FBZ 1 µM은 LPS 유무와 관계없이 골수세포의 세포사를 증가시키는 사실을 확인했다.
고찰
FBZ은 수의에서 광범위하게 사용되는 항기생충제제 중 하나이며[1-3], 최근 종양세포를 이용한 연구에서 항암효과를 갖는다는 사실이 밝혀졌다[6]. 하지만 FBZ의 항염증 효과에 대한 연구는 매우 미흡하며 그 작용기전도 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 FBZ의 항염증 효과를 알아보기 위해 골수세포에 대표적인 염증성 유도물질 중 하나인 LPS를 FBZ과 함께 복합 처리한 후 분석하였다.
FBZ이 세포활성도와 미토콘드리아 막전위를 감소시켜 골수세포의 활성을 억제하였다. 또한, annexin V-FITC/PI 염색과 Hoechst 33342 염색을 통해 FBZ이 염증성 골수세포의 세포사를 유도하는 사실을 확인하였다. 이러한 결과는 LPS 처리로 만들어진 염증성 골수세포에서 FBZ이 세포 수와 미토콘드리아 기능을 모두 감소시킨다는 것을 보여준다. 과립구와 B림프구의 구성 비율 변화를 분석한 결과 FBZ은 LPS가 처리된 골수세포에서 B림프구보다 과립구의 비율을 더 감소시켰다.
FBZ이 과립구의 발현을 선택적으로 억제하는 정확한 기전은 밝혀지지 않았지만, 이를 설명할 수 있는 선행연구들이 있다. 천식 동물모델에서 FBZ이 알레르기성 기도염증과 Th2 사이토카인의 생산을 감소시켰다[12]. FBZ은 기생충 감염증 치료에 다양하게 이용된다[13]. 일반적으로 기생충 감염 시 호산구를 포함한 과립구가 증가되고[14], FBZ이 기생충 치료에 이용되므로, FBZ이 과립구의 숫자 또는 기능에 영향을 미칠 수 있음을 유추할 수 있다. 또한, squirrel monkey를 이용한 앞선 연구에서 총 백혈구, 호중구, 단핵구 및 호산구 수 비교는 FBZ을 처리하지 않은 대조군에 비해 FBZ을 처리한 군에서 현저히 감소한 모습을 보였다[15]. 이를 종합하면 FBZ은 골수세포 중에서도 과립구를 특히 감소시킨다고 생각된다. 반면, FBZ의 농도가 증가함에 따라 전체 생존 세포 수와 과립구는 줄어드는데, 림프구의 절대값은 크게 변하지 않아 상대적인 비율로 림프구가 증가한다고 추측할 수 있다. 다른 연구에서도 절대 림프구 수는 FBZ 치료에 영향을 거의 받지 않았다[15]. 하지만 FBZ은 마우스의 면역체계에 상당한 영향을 미치는 것으로 보아[16], B림프구의 기능이 감소될 가능성은 있다.
다른 연구에서는 설치류에서 FBZ에 의한 골수 억제가 발생하지 않음을 보고하였다[17]. 하지만 본 연구에서는 골수세포에 대한 FBZ의 직접적인 효과를 측정하여 실험조건이 다르다. 또한 LPS에 의해 과도한 염증 반응이 발생한 골수세포를 이용하여 FBZ의 항염증 효과에 대한 연구를 수행했으며, FBZ을 항염증제로 사용할 수 있는 가능성을 확인했다.
이러한 결과를 종합하면, LPS 처리로 인해 염증성 상태가 된 골수세포에서 FBZ은 미토콘드리아 막전위를 불안정하게 만들어 세포사를 유도시켜 항염증 효과를 일으키는 것으로 추정된다. 향후 미토콘드리아와 FBZ의 관련성, 다른 항염증제와의 상승 효과, 다양한 염증이 유도된 동물질환 모델에서의 약효 실험이 추가적으로 필요하다.
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