*Corresponding author: Hu-Jang Lee College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 501 Jinju-daero, Jinju 52828, Korea 서론
전 세계적으로 인구증가와 소득수준 향상으로 육류 및 육가공 식품에 대한 소비는 꾸준히 증가하고 있으며, 양적인 면에서 질적인 면으로 소비패턴이 전환되고 있다[1]. 이들 육류 및 육가공 식품의 품질과 안전성 문제는 소비자와 정책 담당자뿐만 아니라 생산자와 육가공업자들의 주된 관심사가 되고 있다[2].
일반적으로 항생제는 가축의 생산성을 높이고, 질병을 예방하고 치료할 목적으로 사용되고 있다[3,4]. 하지만 이렇게 사용된 항생물질들은 식육 등에 대한 잔류 문제와 항생제 내성균 출현 문제로 인해, 유럽연합(European Union)은 2006년부터 우리나라는 2011년부터 항생제의 배합사료 첨가를 전면 금지하였다[5]. 우리나라의 경우, 배합사료 내 항생제 첨가 전면 금지 이후에, 가축에 대한 항생제 사용이 감소하였으나, 2016년부터 항생제 사용량은 오히려 배합사료 내 첨가 금지 이후보다 증가하였다[1]. 한편, 가축에 사용되는 성장 호르몬 제제들은 성호르몬 수용체에 대해 친화성이 높아서, 식육 및 축산제품에 잔류할 경우에 섭취를 통해 인체 내 호르몬 작용을 방해하는 것으로 알려져 있다[6,7]. 또한 동물용의약품이 잔류하는 식육, 우유, 계란, 꿀벌 등을 섭취할 경우에, 과민반응, 다양한 암 발생, 장내 균총 교란 등이 발생할 수 있다[3].
Tiamulin (TML)은 pleuromutilin 계열에 속하는 반합성 항생제로 valnemulin과 유사한 구조를 갖고 있으며, 세균 50S ribosomal subunit의 23rRNA에 작용하여 peptide 결합을 방해하고 세포벽 합성을 억제함으로써 정균작용을 나타내는 것으로 알려져 있다[8-10]. TML은 Mycoplasma spp. 및 그람 양성균에 대한 항균활성이 뛰어나, 돼지와 닭에서 돈적리, 폐렴, 마이코플라즈마병 등의 예방 및 치료에 사용되고 있다[10]. 한편, TML은 ionophore계 항콕시듐제인 모넨신, 살리노마이신, 나라신 등과 같이 사용하게 되면 폐사를 포함한 상호작용이 발생하기 때문에 TML과 병행해서 사용하면 안된다[11]. TML은 인체에 사용되지 않고 있어서, 가축의 식용 조직에 잔류할 경우에, 인체에 다양한 생물학적 부작용과 알레르기 반응을 유발할 수 있다[12]. 따라서 인체의 안전을 보장하기 위해서는 동물용의약품을 처치한 동물 유래 식용 제품에서 항생제 등 동물용의약품의 잔류를 방지하는 것이 필수적이다[13]. 유럽연합의 Committee for Veterinary Medicinal Product는 닭 근육, 피부/지방, 간에서 TML의 최대잔류허용기준(maximum residue limit, MRL)을 각각 0.1, 0.1, 1.0 mg/kg으로 설정하고 있으며[14], 한국의 식품공전에서는 TML의 MRL을 가금 근육, 신장, 지방에서는 0.1 mg/kg으로, 간에서는 0.2 mg/kg으로 설정하고 있다[15].
미국 등 선진국들은 식품의 안전성을 강화하기 위해 MRL이 설정되어 있지 않은 동물용의약품에 대해 일률 기준치(0.01 mg/kg)로 식품 내 잔류를 관리하는 positive list system (PLS)을 도입하고 있다[16].
우리나라도 2024년 1월 1일부터, 국민들에게 안전한 축·수산물을 공급하기 위해서 잔류허용물질 목록관리제도(PLS)를 시행할 계획이다[17]. PLS 제도 도입에 앞서서, 농림축산검역본부는 잔류성 시험자료가 필요한 동물용의약품들을 선별하여 잔류휴약기간을 재설정하는 사업을 2020년부터 진행하고 있다[18].
본 연구는 우리나라에서 잔류성 시험자료가 필요한 TML 사료첨가제에 대해 가금의 조직들(근육, 간, 신장, 지방)에서 잔류휴약기간을 재설정하기 위해, 육계를 대상으로 수행하였다.
재료 및 방법
시약 및 재료
TML 함유 시험약제(1 kg 중, TML 78 g)는 ㈜성원(South Korea)으로부터 제공받았으며, TML 표준품(순도, 98%), 4-dimethylaminoantipyrine (DAP) 표준품(순도, 97%), acetonitrile (ACN), formic acid (순도, 95%)는 Merck KGaA (Germany)로부터 구입하여 시험에 사용하였다.
실험동물
경상남도 진주 인근 양계장(달성농장, Korea)에서 사육하고 있는 건강한 Ross계 육계 48마리(평균 체중, 959.4±98.4 g)를 구입하여 경상국립대학교 수의과대학 사육장에서 사육하였다. 동물실험은 경상국립대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인을 받아(승인번호: GNU-220121-C00008) 연구윤리지침에 따라 진행하였다.
시험약제 투여 및 시료채취
모든 실험동물은 10일 동안 환경에 적응시킨 후에 시험에 공시하였다. 육계는 시험약제의 최대 권장용량(0.5 kg/ton feed) 투여군(TML-1, n = 24)과 최대 권장용량의 5배 용량(2.5 kg/ton feed) 투여군(TML-2, n = 24)으로 나누어 시험군 별로 시험약제를 사료에 혼합하여 10일 동안 경구 투여하였다. 육계의 조직 시료(근육, 간, 신장, 피부/지방)는 시험약제 투여 종료시점, 투여 종료 후 1, 3, 5일째에 각각 100 g씩 채취하여, 잔류 분석에 사용하였다.
표준원액 및 표준용액의 조제
표준원액 조제를 위해, 정량플라스크(1,000 mL)에 TML 표준품 1.0 mg을 넣고, 메탄올로 1.0 mg/L이 되도록 하였다. 10% ACN을 사용하여 조제한 표준원액을 희석하여 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10, 50, 100 µg/kg의 용액을 준비하여, 냉장실(4℃)에 보관하면서 사용하였다. DAP 표준품 1.0 mg을 정량플라스크(1,000 mL)에 넣고, 메탄올로 1.0 mg/L이 되도록 조제하여, 냉장실(4℃)에 보관하면서 사용하였다.
공시료 2 g에 TML과 DAP 표준용액을 첨가하여 검량선 시료와 QC 시료를 준비하였다. 간, 신장, 근육의 각 공시료에 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 100 µg/kg 농도가 되도록 TML 표준용액을 첨가하였고, 지방의 공시료에는 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 2.5, 5.0, 50 µg/kg 농도가 되도록 TML 표준용액을 첨가한 다음, 모든 시료에 DAP 용액 20 µL씩을 첨가하였다.
시료 전처리
식품공전[19]에 따라, 균질화 시킨 시료 2 g을 원심분리관(50 mL)에 넣고, DAP 용액 20 µL과 ACN 10 mL를 가하여 15분 동안 vortex한 다음, 상온에서 4,700 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액 50 mL를 원심분리관에 넣고 ACN 포화헥산 10 mL을 가한 다음, 10분 동안 vortex하고 상온에서 4,700 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 하층액을 40℃에서 질소로 농축시킨 다음 0.1% 개미산 용액과 메탄올을 각각 2 mL씩을 가하여 재분산시키고, 10분 동안 초음파 처리한 후 4℃에서 4,700 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 취하여 polytetrafluoroethylene membrane filter (0.2 μm; Merck KGaA, Korea)로 여과시킨 것을 시험용액으로 하였다.
기기분석 조건
식품공전[19]의 분석법을 변형하여, 시료 중 TML 분석을 수행하였다. 분석 장비는 liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS, API4000; AB SCIEX, Canada)와 LC system (Agilent 1260 series; Agilent Technologies, Germany)을 사용하였으며, 분석용 column은 Xbridge C18 (2.1 × 100 mm, 3.0 μm; Waters, USA)을 사용하였고, column 온도는 40℃로 하였다. 또한, 이동상 A는 0.1% 개미산 수용액을, 이동상 B는 0.1% 개미산 함유 ACN 용액을 각각 사용하였다. 유속은 0.2 mL/min으로 하였고, 크로마토그래프상 총 running time은 10분으로 하였다. Mass spectrometer는 Triple Quad 4500 System (SCIEX, USA)을 사용하였다. TLM의 이온화는 전기분무이온화법(electro-spray ionization)의 positive-ion mode로 MS 조건을 최적화하였으며, TML과 DAP의 multiple reaction monitoring transition (m/z)는 각각 494.3 → 192.4와 232.0 → 113.2를 사용하였다.
분석법 검증
여러 농도의 표준용액(0.025-100 ng/mL)을 이용하여 작성한 검량곡선의 직선성을 확인하기 위해 상관계수(coefficient of correlation, R2)를 구하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantitation, LOQ)는, 앞선 연구[20]의 방법에 따라, 공시료에 각 시료의 0.5 × MRL (근육, 지방, 신장: 0.05 ng/mL, 간: 0.1 ng/mL) 농도가 되도록 TML 표준용액을 가하여 전처리하여 분석한 chromatogram에서 signal to noise ratio (S/N ratio)의 각각 3배와 10배 농도로 하였다. 회수율 측정은 근육, 간, 신장의 공시료에 TML을 가하여 각각 0.1, 10, 100 ng/mL 농도로 만들고, 지방의 공시료에는 TML을 첨가하여 각각 0.2, 20, 200 ng/mL 농도로 만들어, 3 반복으로 전처리하였다. TML 표준품에 대한 chromatogram의 peak 면적에 대한 추출한 각 시료에서의 peak 면적비로부터 TML의 회수율(%)을 구하였다. 또한 3 반복 회수율로부터 변이계수(coefficient of variation, CV)를 구하였다. 측정된 LOQ, 회수율 그리고 CV의 검증기준은 농림축산검역본부의 동물용의약품 등 잔류성 시험지침(LOQ, 0.5 × MRL 이하; 회수율, 60-120%; CV, 30% 이하) [21]에 따랐다.
TML의 잔류휴약기간 설정
가금의 근육, 간, 신장, 지방에서 TML의 MRL (근육, 신장, 지방 0.1 mg/kg, 간 0.2 mg/kg)을 기준으로, WT 1.4 Program을 이용하여 95% 신뢰수준과 99% 허용한계 상한값을 적용하여 적정휴약기간을 계산하였다[22]. LOQ 미만으로 검출된 시료는 0.5 × LOQ 값을 잔류량으로 하였다.
결과
TML의 크로마토그램
Fig. 1은 공시료에 TML을 LOQ 농도(근육, 간, 신장 0.1 µg/kg, 지방 0.2 µg/kg)가 되도록 첨가하여 전처리한 다음, LC-MS/MS를 이용하여 분석한 chromatogram을 나타낸 것이다. TML의 머무름 시간은 4.56분(근육, 4.57분)이었으며, total run time은 10분이었다. Positive-ion mode에서 기준이온(base ion)으로 검출된 [M+H]+인 m/z 494.3을 선구이온(precursor ion)으로 하였으며, product ion scan을 통하여 특성이온으로 나타난 m/z 192.4를 정성이온으로 하였다.
검량곡선, LOD 및 LOQ
본 시험에서, TML 표준용액을 근육, 간, 신장의 공시료에는 0.05-100 µg/kg의 농도가 되도록 조제하고, 지방에는 0.025-50 µg/kg의 농도가 되도록 조제하여 전처리한 다음, LC-MS/MS로 분석하여 검량선의 R2을 확인하였다. 근육, 간, 신장, 지방에 대한 검량선의 R2는 각각 0.9978, 0.9990, 0.9998, 0.9984였다(Fig. 2). 또한, 근육, 간, 신장에 대한 LOD와 LOQ는 각각 0.03과 0.1 ng/mL였으며, 지방에 대한 LOD와 LOQ는 각각 0.06과 0.2 ng/mL였다.
회수율과 정밀성
Table 1은 육계 조직 시료에서 측정된 TML의 회수율과 정밀성 결과를 나타낸 것이다. 근육, 간, 신장, 지방에서의 회수율 범위는 각각 84.4-95.1, 102-120, 98.0-119, 83.0-103%였으며, CV의 범위는 각각 1.42-3.89, 2.59-3.90, 5.32-9.67, 1.49-7.09%로 나타났다.
조직 중 TML 잔류 분석
Table 2는 육계에 TML을 39와 195 mg/kg 농도로 첨가한 사료를 각각 10일 동안 투여한 후, 경시별로 분석한 조직 시료 중 TML 농도를 나타낸 것이다.
TML-1의 경우, 약제 투여 종료 당일과 종료 후, 1일째부터 5일째까지 간 조직을 제외한 모든 조직에서 TML이 LOQ 미만으로 검출되었으며, 간 조직에서는 투여 종료 당일과 종료 후 1일째에 모두 1개 시료에서 TML이 각각 2.0과 0.5 µg/kg 농도로 검출되었고, 나머지 개체들의 시료 중 TML 농도는 모두 LOQ 농도 미만으로 검출되었으며, 투여 종료 후 3일째와 5일째에는 TML 농도가 모두 LOQ 미만으로 검출되었다. TML-2의 경우, 약제 투여 종료 당일에 근육, 간, 신장 시료 중 각각 2, 6, 2개에서 TML이 LOQ 이상으로 검출되었으나, TML 농도는 모두 MRL 농도(근육, 신장, 지방 0.1 mg/kg, 간 0.2 mg/kg) 미만인 것으로 나타났다. 또한 투여 종료 후 1일째에 근육, 신장, 지방 조직에서 TML은 모두 LOQ 미만으로 검출되었으며, 간 조직에서는 6개 시료 중 1개 시료에서 TML이 LOQ 이상으로 검출되었다.
조직 시료 중 TML 잔류휴약기간 설정
Fig. 3은 간 시료 중 TML의 잔류휴약기간을 계산하기 위해 WT 1.4 Program을 이용하여 산출된 결과를 나타낸 것이다. TML-1과 TML-2에서 근육, 신장, 지방 조직은 약제 투여 종료 후 1일째부터 모든 시료들의 TML 농도가 LOQ 미만으로 검출되어 잔류휴약기간은 모두 0일로 평가되었다. 다만 TML-1과 TML-2의 간 조직에서 적정휴약기간을 WT 1.4 Program으로 계산한 결과, 모두 0일로 산출되어, TML-1과 TML-2의 적정휴약기간은 모두 0일로 평가되었다.
고찰
본 연구에서는 TML을 사료 kg 당 39 mg과 195 mg을 혼합하여 육계에 10일 동안 투여한 다음, 시간대 별로 조직 시료 중 TML 농도를 LC-MS/MS로 분석한 후, 육계 조직 중 TML의 적정휴약기간을 평가하였다.
육계 조직에서 TML 농도를 LC-MS/MS로 분석한 앞선 연구들에서, TML의 chromatogram peak의 머무름 시간은 7.26분[23], 9.72분[24], 9.87분[12]으로 나타났다. 본 연구에서, TML의 chromatogram peak의 머무름 시간은 4.56-4.57분으로, 앞선 연구들[12,23,24]에 비해 peak의 머무름 시간이 매우 짧게 나타내었다. 이와 같이, 크로마토그램 peak의 머무름 시간에 차이가 발생한 것은 분석기기의 설정 조건이 달라서 발생한 것으로 판단된다[20]. 본 연구에서 확립한 육계 조직 중 TML의 잔류 분석 방법은 식품공전[19]의 시험법과 비교해서도 분석시간이 단축되어 분석의 효율성을 증진시켰다.
앞선 연구들 모두에서[23-25], TML에 대한 검량곡선의 R2가 0.999 이상을 나타내었다. 앞선 연구들과 비교하여, 본 연구에서 TML에 대한 검량선의 R2는 0.9978-0.9998로 다소 낮거나 유사하였으며, Codex 기준(0.98)을 충족하였다[26].
식품공전에 따르면[15], 가금 근육, 간, 신장, 지방 중 TML의 MRL은 각각 0.1, 0.2, 0.1, 0.1 mg/kg으로 설정하고 있다. 본 연구에서 TML 잔류 분석에 사용한 분석법은 가금 식용 조직 중 TML을 0.5 × MRL 이하로 분석 가능한 것으로 평가되었다. 농림축산검역본부의 동물용의약품등 잔류성 시험지침에 따르면[21], 분석기기의 LOQ 기준을 0.5 × MRL 이하로 하고 있다. 따라서 본 연구에서 확립한 TML의 LOQ (근육, 간, 신장 0.1 µg/kg, 지방 0.2 µg/kg)는 동물용의약품등 잔류성 시험지침[21]의 기준을 충족하였다. LC-MS/MS를 이용하여 TML의 잔류를 분석한 연구들에서, Zhang 등[23]은 가금 근육에서 TML에 대한 LOD와 LOQ가 각각 0.3과 2.0 µg/kg이었다고 보고하였으며, Yamada 등[25]은 가금 근육에서 TML의 LOD와 LOQ가 각각 0.2와 0.5 µg/kg이었다고 보고하였으며, Patyra 등[27]은 가축 사료에서 TML의 LOD와 LOQ가 각각 92.2와 128.0 µg/kg이었다고 보고하였다. 본 연구에서 TML의 LOD와 LOQ는 앞선 연구들에 비해 모두 낮게 나타나, TML에 대한 검출감도가 높은 것으로 나타났다.
농림축산검역본부의 동물용의약품등 잔류성 시험지침에 따르면[21], 0.1 µg/kg 이하의 농도에서, 회수율과 CV는 각각 50-120%와 35% 이하이여야 하며, 1-10 µg/kg 농도에서, 회수율과 CV는 각각 60-120%와 30% 이하이여야 하며, 10-100 µg/kg 농도에서, 회수율과 CV는 각각 70-110%와 20% 이하이여야 한다고 분석법의 요건을 정하고 있다. 본 연구에서 TML (0.1-100 µg/kg)의 회수율과 CV는 각각 83.0-120.0%와 1.42-9.67%로 나타나, 동물용의약품등 잔류성 시험지침[21]에서 제시한 분석법 요건을 모두 만족하였다. 가금 조직 중 TML의 회수율과 CV의 범위는, Zhang 등[23]의 연구에서는 각각 73.3-76.8%와 6.5-10.0%였으며, Yamada 등[25]의 연구에서는 각각 81.5%와 12.7%였으며, Patyra 등[27]의 연구에서는 각각 116.5%와 6.97-19.53%였다고 보고하였다. 본 연구의 회수율은 앞선 연구결과들과 유사하였으며, CV는 Zhang 등[23]의 연구결과와 비슷하였으나, Yamada 등[25]과 Patyra 등[27]의 연구결과보다는 낮게 나타났다.
Vinothini 등[28]은 육계에 TML을 체중 kg 당 40 mg을 사료에 혼합하여 3일 동안 투여한 후, 1, 3, 5일째에 근육, 간, 피부/지방 시료를 채취하여 TML의 잔류 농도를 분석한 결과, 약제 투여 후, 1일째에 근육, 간, 피부/지방 시료 중 TML 농도는 각각 0.25, 2.6, 0.03 mg/kg이었으며, 3일째에는 간 시료에서 만 0.11 mg/kg이었으며, 5일째에는 모든 시료에서 LOQ 미만으로 검출되었다고 보고하였다. Ciucă 등[12]은 육계에 TML을 체중 kg 당 20 mg씩을 7일 동안 강제로 경구 투여한 후, 1, 3, 7일째에 근육, 간, 피부/지방 조직을 채취하여 TML의 잔류 농도를 LC-MS/MS로 분석한 결과, 1일째에 근육, 간, 피부/지방 조직 중 TML 농도는 각각 91.2, 462.8, 121.0 µg/kg이었으며, 3일째에 근육, 간, 피부/지방 조직 중 TML 농도는 각각 37.8, 164.8, 49.0 µg/kg이었고, 7일째에 근육, 간, 피부/지방 조직 중 TML 농도는 각각 20.1, 100.8, 21.1 µg/kg이었다고 보고하였다. Elazab 등[13]은 오리에 TML을 체중 kg 당 40 mg을 3일 동안 강제로 경구 투여한 후, 1, 3, 5, 7, 9일째에 근육, 간, 지방 시료를 채취하여, TML의 농도를 분석한 결과, 1일째에 근육, 간, 지방 조직 중 TML 농도는 각각 0.89, 3.62, 0.28 mg/kg이었으며, 3일째에 근육, 간, 지방 조직 중 TML 농도는 각각 0.31, 1.48, 0.05 mg/kg이었고, 5일째에 근육과 간 조직 중 TML 농도는 각각 0.04와 0.73 mg/kg이었으며, 약제 투여 후 7일째에는 간 조직에서 만 TML이 0.17 mg/kg으로 검출되었다고 보고하였다. 앞선 연구들은 모두 본 연구에서 투여한 TML의 용량과 비교하여 고용량의 TML을 투여하였으나, 본 연구에서와 같이 간 조직에서의 TML 잔류 농도가 다른 조직들에 비해 더 높게 더 오랫동안 검출되었다. 본 연구의 TML-2와 유사한 농도를 투여한 Ciucă 등[12]의 연구결과에서, 약제 투여 후 1일째에 간 조직의 TML 잔류 농도는 본 연구결과에 비해 높게 나타났다. 이러한 결과는 대상 육계의 종류, 체중의 차이, TML의 잔류분석법의 차이로부터 기인한 것으로 추정된다.
본 연구에서 사료 kg 당 TML을 39와 195 mg을 혼합하여 육계에 10일 동안 투여하고, 조직 시료를 채취하여 TML의 잔류분석 결과를 바탕으로 설정한 적정휴약기간이 모두 0일이었다. 투약 종료시점에 TML-2의 간 조직 중 TML 잔류 농도는 TML-1에 비해 높았으나, 투약 종료 후 1일째에는 TML-1과 TML-2의 간 조직에서 LOQ 이상으로 검출된 시료수는 모두 1 개씩이었으며, 투약 종료 후 3일째에는 TML-1과 TML-2의 모든 조직들의 TML 농도가 LOQ 미만으로 나타나, TML-1과 TML-2의 잔류휴약기간이 동일하게 0일로 나타났다. Vinothini 등[28]은 육계에 TML을 체중 kg 당 40 mg을 사료에 혼합하여 3일 동안 투여한 결과, 육계의 식용 조직 중 잔류휴약기간은 5일 이하라고 보고하였다. Ciucă 등[12]은 육계에 TML을 체중 kg 당 20 mg씩을 7일 동안 강제로 경구 투여한 결과, 육계의 식용 조직 중 잔류휴약기간은 3일 이하라고 보고하였다. 하지만 농림축산검역본부 동물용의약품관리시스템에서[29], TML 함유 약제를 최대 권장용량(TML 39 g/kg feed)으로 투여할 경우, 가금의 식용 조직에서 잔류휴약기간을 7일로 설정하고 있다. 본 연구에서 권장용량을 투여한 경우, TML의 육계 조직 중 잔류휴약기간은 앞선 연구들과 비교하여 낮게 설정되었다.
이상의 연구결과로부터, 본 연구에서 육계의 식용 조직 중 TML의 잔류분석에 사용한 분석법의 회수율, CV, 검출감도 등은 농림축산검역본부의 동물용의약품 등 잔류성 시험지침[21]의 기준을 모두 충족하였다. 또한 본 연구에서 산출된 육계 조직 중 TML의 잔류휴약기간은 시험약제에 설정되어 있는 잔류휴약기간보다 짧게 평가되어, 육계에 대한 TML 함유 약제의 투여 시 출하시기를 단축시킬 수 있을 것으로 생각된다.
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