축산 현장에서 사용되는 3종류 대인방역기의 Salmonella Typhimurium과 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 소독 효과 검증
Verification of disinfection effect on Salmonella Typhimurium and low pathogenic avian influenza of 3 types of human body sterilizer used in livestock fields
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In the livestock field, human body sterilizer is one of the methods used to prevent the spread of contagious animal diseases. Disinfection methods include spraying disinfectants, irradiating ultraviolet rays, and generating anions using photocatalysts; however, their effectiveness remains to be clarified. Therefore, in this study, we aimed to verify the pathogen-killing efficacy of the human body sterilizer and propose improvements. Experiments were conducted using a disinfectant spraying model and an ultraviolet single and ultraviolet-photocatalyst composite model. In the bactericidal experiment using Salmonella Typhimurium, the killing effect recorded in both hard and organic conditions did not exceed the standard value. The disinfectant spraying model showed a relatively high effect on the mannequin’s shoulders and arms. Meanwhile, in the virucidal experiment using low pathogenic avian influenza, the killing effect observed in both hard and organic conditions did not exceed the standard value, and no significant difference was observed between the models by site. Notably, the disinfectant spraying model showed a tendency to increase pathogen reduction with increasing exposure time in both bacterial and viral experiments. Human body sterilizer has limitations such as damage from drug exposure, short periods of physical exposure, and the lack of their own disinfection function. Given the current challenges in manufacturing an ideal human body sterilizer, supplementary measures should be implemented to prevent the spread of pathogens by farm entrants. These measures include efficiently utilizing shoe disinfectants, which are crucial in pathogen prevention, and providing disposable clothing.
서론
축산 현장에서는 사람을 매개로 전파될 수 있는 가축전염병의 확산을 방지하기 위한 한 방법으로 다양한 모델의 대인방역기를 설치 및 운용하고 있다. 중•대규모 가축사육농장, 축산분야 위생 및 방역 관련 연구소, 축산식품 제조 및 가공업체 등을 포함한 국내 축산분야에서의 대인방역기 총 수요는 약 2만 대일 것으로 추정되며[1], 일반 보건분야까지 포함하면 그 수는 상당할 것으로 예상된다.
가축전염병 예방법 제17조에 따르면, 50제곱미터 이상의 가축사육시설은 출입자의 신발을 소독할 수 있는 소독조와 옷 등을 소독할 수 있는 분무용 소독시설 또는 자외선 살균기를 설치해야 한다[2]. 이에 해당하는 규모의 축산 관련 시설에서는 대인방역기의 설치가 의무적으로 시행되고 있으며, 현장에서 사용되는 소독제에 대한 효력 검증은 농림축산검역본부 고시 소독제 효력시험지침에 따라서 이루어지고 있다. 그러나 소독 시설 및 장비에 관한 구체적인 규격과 적절한 사용 방법에 대한 가이드라인은 국내의 규정이나 고시 등 어느 곳에도 제시되지 않아 현재 국내 축산 현장에서는 무작위적으로 제작된 방역기들이 설치 및 운영되고 있다[3].
현재 국내에서 제작 및 판매되고 있는 대인방역기의 소독 기능은 소독제를 분사하는 방법과 자외선을 조사하는 방법 및 광촉매에 의한 음이온을 생성하여 활용하는 방법을 사용하고 있다. 이 연구는 위 세 가지 소독 방법을 적용한 대인방역기들을 대상으로 일반적인 사용조건에서의 병원체 사멸 효과를 검증하여 대인방역시설의 개선 방향을 제시하고자 하였다. 신발은 사람을 매개로 한 병원체 전파 경로에서 중요한 소독 부위지만[4], 현장에서 활용되는 방법이 매우 다양하여 신발을 제외한 체표에 오염된 병원체의 소독 효과를 평가하였다.
재료 및 방법
세균 준비
농림축산검역본부에서 분양 받은 Salmonella Typhimurium (American Type Culture Collection/ATCC 13311)을 실험에 사용하였다. 액체영양배지(Difco, USA)에 접종하여 37℃ incubator에서 24시간 배양하였으며, 108 colony-forming unit (CFU)/mL 이상의 역가가 되도록 준비하였다.
바이러스 준비
농림축산검역본부에서 분양 받은 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV) A (Chicken/Korea/MS/1996)를 실험에 사용하였다. 10일령 계태아 발육란의 allantoic fluid에 접종하여 37℃ incubator에서 72시간 배양한 후, 4℃에서 3시간 정치하고 allantoic fluid를 회수하여 원심분리(3,000 rpm, 4℃, 20 min)하였다. 바이러스를 함유한 allantoic fluid는 세계동물보건기구 표준[5]에 따라 haemagglutination test와 Spearman-Karber method [6,7]를 이용하여 EID50/mL을 확인하였으며, 107.5 EID50/mL 이상의 역가가 되도록 하여 사용 직전까지 –70℃에서 보관하였다.
소독제 준비
소독제는 미산성 차아염소산수(hypochlorous acid water; HOCl, 70 ppm)를 사용하였다. 차아염소산수는 환경부에서 승인한 자가소독용 살균제로 세계보건기구(World Health Organization)와 유럽연합(European Union)에서 코로나바이러스병-19 (coronavirus disease 2019, COVID-19)에 대해 소독 효과를 인정하여 국내에서 COVID-19 발생 이후 일반소독액을 살포하는 공간에서 가장 널리 사용되고 있는 약제이다[8]. 또한 현재 국내에서 사용되는 많은 차량용 소독기에서 사용되고 있는 점을 고려하여 지표 소독 물질로 선택하였다[9].
현탁액 시험
농림축산검역본부 소독제 효력시험지침[10]의 내용에 따라 수행하였으며, 세부적인 절차 및 내용은 아래와 같다.
Salmonella Typhimurium (ATCC 13311) 4 mL를 경수 또는 5% 유기물(Y.E, Bacto, USA) 96 mL에 섞은 후 대조군과 실험군으로 나누었으며, 실험군의 경우 혼합액 2.5 mL를 4℃로 보관한 동량의 소독제(HOCl, 70 ppm)가 들어있는 5개 시험관에 배합하였다. 30분간 반응하고, 중화를 위해 회수액 1.0 mL을 20% 효모추출물(Y.E, Bacto) 용액 9.0 mL에 혼합한 후 10진 희석하였다. 이후 3M Petrifilm aerobic count plates (3M, USA)에 1.0 mL씩 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 소독제 유효희석배수 결정은 농림축산검역본부 고시 기준을 따랐다[11].
LPAIV (H9N2) 1 mL를 경수 또는 5% 유기물(fetal bovine serum, FBS) 19 mL에 섞은 후 대조군과 실험군으로 나누었으며, 실험군의 경우 혼합액 2.5 mL를 4℃로 보관한 동량의 소독제(HOCl, 70 ppm)가 들어있는 5개 시험관에 배합하였다. 30분간 반응하고, 중화를 위해 회수액 1.0 mL을 10% FBS 용액 9.0 mL에 혼합한 후 10진 희석하였다. 이후 5개의 10일령 발육란에 0.2 mL씩 접종하여 37℃에서 5일간 배양하면서 매일 검란하여 haemagglutination test와 Spearman-Karber method를 통해 EID50/mL을 확인하였다.
담체 시험
농림축산검역본부 소독제 효력시험지침[10]의 내용에 따라 수행하였으며, 세부적인 절차 및 내용은 아래와 같다.
지름 2 cm, 두께 1.5–1.8 mm인 유리 재질(POSCO, Korea)의 원형 담체를 사용했으며, 사용 전 멸균 증류수로 2회 세척 후 고압 멸균(121℃, 15 min) 처리하였다.
Salmonella Typhimurium (ATCC 13311)과 경수 또는 5% 유기물(Y.E, Bacto)을 동량으로 섞은 후, 담체에 100 μL씩 접종하여 공기의 흐름이 있는 상태인 무균시험대에서 50분 건조하였다. 건조된 담체는 실험에 사용되는 세 가지 모델 대인방역기 내 마네킹 지정 위치에 부착 후, 15, 30, 45초 소독을 실시하였다. 반응 시간 후 각 담체들은 중화배지 20% 효모추출물(Y.E, Bacto) 튜브에 무균 상태로 넣고 10분간 교반하였다. 중화반응이 끝난 액체는 희석액(0.85% sterile normal saline)을 이용하여 10진 희석 후, 3M Petrifilm aerobic count plates에 1.0 mL씩 접종하여 세균 함량을 측정하였다.
LPAIV (H9N2)와 경수 또는 5% 유기물(FBS)을 동량으로 혼합 후, 담체에 100 μL씩 접종하여 공기의 흐름이 있는 상태인 무균시험대에서 50분 건조하였다. 건조된 담체는 대인소독기 내 마네킹 지정 위치에 부착 후, 15, 30, 45초 소독을 실시하였다. 각 담체는 반응 시간 후 중화배지 10% FBS 튜브에 무균 상태로 넣고 10분간 교반하였다. 중화반응이 끝난 혼합액은 0.45 μm 필터 처리한 PBS (Sigma-Aldrich)에 10진 연속 희석하여 5개의 10일령 발육란에 0.2 mL씩 접종하였다. 검란을 통해 첫날 죽은 발육란은 폐기하고 37℃에서 5일간 배양하였다. 배양이 끝난 발육란은 haemagglutination test와 Spearman-Karber method를 통해 EID50/mL을 확인하였다.
대인방역기 제원
이 연구에서는 축산 현장에 보급된 대표적인 세 가지(소독제 분사, 자외선, 광촉매) 소독 방법을 적용한 대인방역기를 사용하였다. 미산성 차아염소산수(70 ppm) 분사 모델(초음파진동; 20,000/sec, 입자; 5 μm, 분무량; 50-60 mL/min, 크기; W1,300 × L1,000 × H2,100), 자외선 모델(출력; 4.9W × 8ea, 크기; W1,200 × L15,00 × H2,300), 자외선 광촉매 복합 모델(광촉매 출력; 3W × 1ea, 자외선 출력; 4.9W × 8ea, 크기; W1,200 × L1,500 × H2,300) 3가지 형태를 대상으로 실험하였다(Fig. 1).
The inside view of the sterilizer. (A) Disinfectant spray type, (B) ultraviolet (UV) irradiation single type, (C) UV and photocatalytic composite type.
담체 부착 및 소독
각 대인방역기 내 마네킹을 위치시킨 후, 담체를 Petri dish (15 × 90 mm; SPL, Korea) 안에 3개씩 넣어 어깨, 팔, 허벅지 부위에 부착하였다(Fig. 2). 실험은 소독기 실제 사용 시간(15, 30, 45초)과 유사하게 설정하여 진행하였으며 경수와 유기물 조건으로 각 병원체들의 감소 수치를 측정하였다(N = 5, n = 5).
Mannequin indicating the carrier attachment position.
통계분석
데이터 분석을 위해 GraphPad Prism 8 소프트웨어(ver. 8.4.3; GraphPad Inc., USA)를 사용하였다. 모든 데이터는 log10값의 평균 및 표준편차로 표현되었다. 또한 변량분석을 위하여 ANOVA 분석을 통해 데이터 평균값 간 유의적인 통계적 차이(p < 0.05) 유무를 확인하였다.
결과
현탁액 시험 결과
세균 유효성 평가 결과
차아염소산수(70 ppm)가 세균 소독에 적합한지 확인하기 위해 현탁액 실험을 진행하였다.
경수 조건에서 대조군 평균 6.8 log, 실험군 평균 0 log 내외로 세균이 대부분 사멸하였으며, 유기물 조건에서는 대조군 평균 6.5 log, 실험군 평균 4.9 log로 세균이 약 1.6 log 감소하였다(n = 5). 두 조건 모두 대조군 대비 실험군에서 세균 저감의 유의한 통계적 차이(p < 0.05)를 보였다(Fig. 3). 경수 조건에서는 농림축산검역본부 인증 기준 이상의 효과가 확인되었으나, 유기물 조건에서는 인증 기준치에 미치지 못했다.
Effects of hypochloric acid on bacterial reduction. HW, hard water; OM, organic matter. *p < 0.05, **p < 0.01.
바이러스 유효성 평가 결과
차아염소산수(70 ppm)가 LPAIV 소독에 적합한지 확인하기 위해 현탁액 실험을 진행하였다.
경수 조건에서 대조군 평균 6.3 log, 실험군 평균 0 log 내외로 바이러스가 대부분 사멸하였으며, 유기물 조건에서는 대조군 평균 6.2 log, 실험군 평균 4.7 log로 바이러스가 약 1.5 log 감소하였다(n = 5). 두 조건 모두 대조군 대비 실험군에서 바이러스 저감의 유의한 통계적 차이(p < 0.05)를 보였다(Fig. 4). 경수 조건에서는 농림축산검역본부 인증 기준 이상의 효과가 확인되었으나, 유기물 조건에서는 인증 기준치에 미치지 못했다.
Effects of hypochloric acid on virus reduction. HW, hard water; OM, organic matter.
*p < 0.05, **p < 0.01.
담체 시험 결과
세균 유효성 평가 결과
경수 조건에서, 모든 모델에서의 실험 결과 세균 감소 수치가 농림축산검역본부 고시 소독제 효력시험지침의 기준인 5 log에 미치지 못했다(Fig. 5). 유기물 조건에서는 모든 모델에서 1 log 미만으로 기준치에 크게 미달되어 현탁액 시험 결과와 마찬가지로 소독 효력이 아주 미약함을 확인하였다(Fig. 6).
Bacterial reduction effects according to disinfection site and device type under hard water (HW) conditions.
UV, ultraviolet; P, photocatalyst.
*p < 0.05, **p < 0.01.
Bacterial reduction effects according to disinfection site and device type under organic matter (OM) conditions.
UV, ultraviolet; P, photocatalyst.
경수 조건에서는 소독제 분사 모델이 어깨와 팔 부위에서 비교적 높은 소독 효력을 보였고(p < 0.05), 허벅지 부위에서는 세 모델 간 유의한 차이가 없었다(Fig. 5). 유기물 조건에서는 모델 간 부위별로 소독 효력에서의 유의한 차이가 없었다(Fig. 6). 경수 조건과 유기물 조건 간의 세균 감소 수치 차이는 소독제 분사 모델의 결과값이 가장 유의하게 나타났다(p < 0.05). 또한 소독제 분사 모델에서는 노출 시간 증가에 따른 세균 감소 수치 증가 경향이 나타났다(Figs. 5, 6).
바이러스 유효성 평가 결과
경수 조건에서, 모든 모델에서의 실험 결과 바이러스 감소 수치가 농림축산검역본부 고시 소독제 효력시험지침의 기준인 4 log에 미치지 못했다(Fig. 7). 유기물 조건에서는 모든 모델에서 1 log 미만으로 기준치에 크게 미달되어 소독 효력이 아주 미약함을 확인하였다(Fig. 8).
Virus reduction effects according to disinfection site and device type under hard water (HW) conditions.
UV, ultraviolet; P, photocatalyst.
Virus reduction effects according to disinfection site and device type under organic matter (OM) conditions.
UV, ultraviolet; p, photocatalyst.
경수 조건과 유기물 조건 모두에서 모델 간 부위별로 소독 효력에서의 유의한 차이가 없었다(Figs. 7, 8). 또한 경수 조건과 유기물 조건 간의 바이러스 감소 수치 차이는 모든 모델에서 통계적으로 유의하지 않았다(p > 0.05). 소독제 분사 모델에서는 노출 시간 증가에 따른 바이러스 감소 수치 증가 경향이 나타났다(Figs. 7, 8).
고찰
대인방역기는 전염병의 확산을 방지하기 위해 고안되어 축산 현장을 포함한 다양한 분야에서 활용되고 있지만, 기기에 적용할 수 있는 소독 방법의 한계가 분명히 존재한다. 이 연구에서 검증하고자 하였던 소독 기능 자체의 한계뿐만 아니라 약품 노출에 의한 사용자의 피해에 대한 우려, 물리적 노출 시간 제한에 따른 소독 효력의 부족 등이 대인방역기의 한계성을 드러낼 수 있다.
이러한 문제점에도 불구하고 대인방역기는 사람 체표에 의한 병원체의 전파 가능성을 낮추기 위해 설치 및 운용되고 있다. 그러나 현재 국내에는 기기의 제작과 설치 및 운용에 대해 적절한 기준이 제시된 가이드라인이 없어 효력이 검증되지 않은 기기들이 무작위적으로 보급되고 있다[12,13]. 축산 현장의 특성을 고려하여 유기물 조건에서 병원체 사멸 효과를 발휘하는 방역기를 개발하거나, 새로운 방식의 소독 시스템을 고려할 필요가 있다.
소독제를 분사하는 모델에서는 최근 미산성 차아염소산수를 많이 사용하고 있다. 미산성 차아염소산수는 무기물 상태에서 LPAIV에 대한 소독 효력이 뛰어나지만, 유기물이 존재하면 효력이 급감하는 것으로 알려져 있다[14]. 이 연구에서도 현탁액 시험 결과 경수 조건에서는 농림축산검역본부 인증 기준 이상의 소독 효과가 나타났으나 유기물 조건에서는 인증 기준치에 미치지 못했다. 담체 시험에서도 유기물이 존재하는 경우 소독 효력이 현저히 감소하였다. 이러한 이유로 차아염소산수는 유기물 오염이 많은 축산분야에서는 소독제로서 적합하지 않다고 생각된다.
경수 조건에서 소독제 분사 모델이 어깨와 팔 부위에서 자외선 단일 모델과 자외선•광촉매 복합 모델에 비해 높은 소독 효력을 보인 이유는 소독제 분사 노즐과 자외선 램프의 위치 차이 때문일 것으로 생각된다. 실험에 사용한 소독제 분사 모델은 노즐이 어깨•팔•허벅지 위치에 고루 분사될 수 있도록 분포되었으나 자외선을 활용한 모델들은 자외선 램프의 위치가 천장과 다리 부근에 한정되었다.
자외선은 파장, 소독 대상과의 거리 및 노출 시간에 따라 병원체 저감 효과가 다르게 나타난다. 소독에 효과적인 자외선 파장 영역은 260 nm의 단파장에 속하는 ultraviolet (UV)-C이다[15]. 자외선을 활용해 소독 효과를 나타내기 위해서는 소독 대상이 24 m 이내에 위치해야 하며, 최소 20–25분은 노출되어야 한다[16]. 실험에 사용한 대인방역기의 자외선 램프는 UV-C를 활용하였고 소독 대상과의 거리도 적합하였으나, 조사 시간은 일반적으로 소독 효과가 인정되는 시간에 비해 현격히 짧았다. 15–45초 실험 결과 모든 부위에서 세균 및 바이러스 감소 수치가 소독 효력 기준치에 미치지 못했다. 대인방역기의 경우 실제 현장 상황에서 자외선을 1분 이상 조사하기는 어렵다.
광촉매를 활용하는 모델은 주로 자외선과 병용하여 복합 모델로 이용된다. 흔히 사용되는 광촉매인 이산화티타늄은 독성이 없고 광활성이 우수하다. 광촉매는 공기 중의 수증기와 반응하여 OH‾를 생성하는데, 이 라디칼은 유기물질들을 산화 및 분해할 수 있다[17]. 그러나 촉매와 접촉해야 소독이 되기 때문에 에어샤워와 자외선을 이용하여 미생물을 공기 중으로 부유시켜 접촉 시간을 길게 만드는 방식을 활용한다.
모든 모델에서 바이러스는 세균에 비해 유기물의 영향을 적게 받는 것으로 나타났다. 유기물이 바이러스에 미치는 영향은 상반된 연구결과들이 보고되고 있다. 유기물이 바이러스의 부착능을 증가시킨다는 견해가 있는 한편, 유기물이 바이러스의 부착 지점을 차지하여 부착을 방해한다는 견해도 있다[18].
차량을 대상으로 하는 거점소독시설에 관한 유효성 평가 연구에서는 차아염소산은 단독 사용만으로도 소독 효과를 발휘하나 자외선은 단독 사용할 경우 소독 효과가 나타나지 않았다[3]. 그러나 이 연구에 사용한 대인방역기는 차아염소산수, 자외선 단독 및 자외선•광촉매 복합 모델에서 모두 기준치 이상의 소독 효과가 나타나지 않았다.
차아염소산수의 경우 인체에 비교적 무해하다고 알려져 있으나[19], 대인방역기에서와 같이 분사 형태로 사용할 때에 호흡기에 노출되면 상피세포를 손상할 수 있다[20]. 또한 UV-C는 장시간 노출 시 피부 세포의 DNA를 손상하고 각막과 결막의 자극을 유발할 수 있다[21].
인체에 무해하며 농림축산검역본부 고시 소독제 효력시험지침에서 인정하는 소독 효력을 발휘하는 이상적인 방역기의 제작은 현재로서는 어려울 것으로 생각된다. 현재 제작되고 있는 방역기 모델의 한계점을 인정하고, 농장 출입자에 의한 병원체 전파를 방지할 수 있는 다른 방법을 병용해야 할 필요성이 매우 높다고 판단된다.
농장에서 사람을 매개로 한 병원체 전파에 가장 중요한 역할을 하는 신발의 경우 법률상으로 소독조를 필수로 설치할 것을 명시하고 있을 뿐만 아니라[2], 농촌진흥청에서 농장 출입구에 신발 세척기를 비치하도록 권고하여 장화에 묻은 유기물질을 제거할 수 있도록 가이드라인을 제시하고 있다[22]. 또한 농촌진흥청은 신발 소독조에서 소독액 사용 시 권장 희석 배율을 지키고, 2–3일 간격으로 교체 주기를 관리할 것을 권고하고 있다[23].
방역기의 성능을 끌어올리기 위해서는 적절한 소독 시간을 준수할 수 있도록 기기에 자동화 시스템을 도입해볼 수 있다. 소독을 시작한 시점을 기기가 인식하여 정해진 시간이 지난 뒤 알람이나 안내 음성을 내보내는 방식을 사용할 수 있다. 체표의 경우 장화처럼 깨끗이 씻어낼 수 없으므로 덧입을 수 있는 일회용 외의를 구비해 두는 방법이 또 다른 보완책이 될 수 있을 것이다. 방역기의 부족한 소독 효력을 보완하는 방법들과 신발 소독조를 함께 활용하면 가축전염병 병원체 전파 방지의 효율을 높일 수 있을 것으로 생각된다.
Notes
The authors declare no conflict of interest.
Author’s Contributions
Conceptualization: Kim Suk; Data curation: Kim Suk, Park Y; Formal analysis: Park Y; Funding acquisition: Choe N; Investigation: Kim Suk, Park Y; Methodology: Kim Suk; Project administration: Choe N; Software: Kim J; Resources: Kim Sung, Kim J; Supervision: Choe N; Validation: Kim Suk, Kim Sung; Visualization: Park Y; Writing–original draft: Kim Suk; Writing–review & editing: Park Y.
Funding
This study was supported by Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in food, agriculture and forestry (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 2019, Korea).